Menetelmän nimi ei kuitenkaan yksin kerro, mitä raportti dokumentoi. On oltava selvää, mitä signaalia mitattiin, mitä laskentaa käytettiin ja mitä aineita menetelmä voi erottaa toisistaan.
HPLC osoittaa erotuksen tietyissä oloissa
HPLC tarkoittaa high-performance liquid chromatography eli korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa. Näytteen komponentit kulkevat kolonnin läpi nestevirtauksen mukana. Vuorovaikutuksen erot kolonnin ja nesteen kanssa aiheuttavat erilaisia retentioaikoja eli aikoja aineen havaitsemiseen detektorilla.
Kromatogrammi näyttää detektorin signaalin ajan suhteen. Peptidianalyyseissä käytetään usein UV-detektointia. Pääpiikki ja pienemmät piikit voivat kertoa koostumuksesta, mutta kaksi ainetta voi myös poistua samaan aikaan. Yksi piikki ei siksi välttämättä edusta vain yhtä ainetta.
Retentioaika liittyy analyysiolosuhteisiin. Yhden menetelmän aikaa ei voi käyttää yleispätevänä tunnisteena toisessa. Raportin on annettava riittävästi tietoa, jotta laboratorio voi selittää piikkien ja pinta-alalaskennan merkityksen.
LC-MS yhdistää massatiedon piikkeihin
Massaspektrometri havaitsee ioneja massan ja varauksen suhteen, m/z, perusteella. Peptidit voivat tuottaa ioneja, joilla on useita varauksia. Signaalien tulkinnasta voidaan laskea molekyylimassa, jota verrataan odotettuun massaan.
Zeng ja kollegat tutkivat vuonna 2015 LC-HRMS:ää eli nestekromatografiaa yhdistettynä korkean erotuskyvyn massaspektrometriaan kolmen peptidilääkkeen laadunvalvonnassa. Työ osoittaa, miten massatieto voi auttaa tutkimaan epäpuhtauksia ja näytteiden välisiä eroja, joita kromatografia ei yksin selitä riittävästi.
Odotukseen sopiva massa on hyödyllinen tieto. Samanmassaiset rakenteet voivat kuitenkin vaatia lisätutkimuksia. LC-MS/MS analysoi valittujen ionien fragmentteja ja voi antaa lisätietoa sekvenssistä. Itse tulkinnasta on käytävä ilmi, mitä on vahvistettu.
Valitse mittaus kysymyksen mukaan
Puhtausprofiili, identiteetti ja määrällinen pitoisuus vaativat eri arviointeja. Pitoisuuden määrityksessä tarvitaan määritelty suhde määrän ja mittaussignaalin välille. Siihen voi kuulua muun muassa kalibrointi ja soveltuva vertailumateriaali. Kromatografisen piikin pinta-ala ei ole automaattisesti valmis määrämitta.
Massaspektrometrisen signaalin voimakkuuteen vaikuttavat myös ionisaatio ja instrumenttiolosuhteet. Kaksi ainetta voi tuottaa erilaisia signaaleja samalla määrällä. Yhden MS-signaalin jakaminen kaikkien signaalien summalla ei siksi suoraan anna luotettavaa massaprosenttia.
| Kysymys | Oleellinen tieto | Rajoitus |
|---|---|---|
| Mitkä komponentit erottuvat? | Kromatogrammi ja menetelmäkuvaus | Komponentit voivat olla päällekkäisiä |
| Vastaako massa odotusta? | Tulkittu LC-MS tai LC-HRMS | Samalle massalle voi olla useita rakenteellisia selityksiä |
| Onko sekvenssi tutkittu? | LC-MS/MS-fragmenttitiedot ja mahdollinen lisäanalyysi | Kattavuus ja tulkintaperusta on arvioitava |
| Kuinka paljon peptidiä on? | Kvantitatiivinen menetelmä, jolla on määritelty laskentaperusta | Pinta-alapuhtaus ei yksin vastaa tähän |
Menetelmän on sovelluttava kyseiseen näytteeseen
Selektiivisyys kuvaa, kuinka hyvin menetelmä erottaa analyytin muista komponenteista. Toistotarkkuus koskee mittausten välistä vaihtelua; oikeellisuus koskee tulosten vastaavuutta hyväksyttyyn vertailuarvoon. Näitä ominaisuuksia arvioidaan kyseisessä analyysitehtävässä, ei vain instrumenttityypille.
LC-MS/MS-järjestelmien tutkimuksissa käytetään myös muun muassa kromatografisen suorituskyvyn, massatarkkuuden ja signaalivoimakkuuden mittareita. Tällaiset tarkistukset voivat paljastaa järjestelmän toiminnan muuttuvan sarjasta toiseen. Ne antavat syyn kysyä järjestelmän soveltuvuudesta raportteja verrattaessa.
Yhdelle peptidille hyvin toimiva menetelmä ei välttämättä ole yhtä selektiivinen toiselle. Nimityksiin kuten HPLC-testattu tai MS-vahvistettu on siksi liitettävä konkreettinen selitys testin sisällöstä.
Muut ominaisuudet vaativat omat tutkimuksensa
Steriiliys, endotoksiinit ja liuotinjäämät ovat omia analyysialueitaan. Tavallinen kromatogrammi tai massaspektri ei anna niistä yhteistä päätelmää. Mahdollisten tulosten on oltava erillisiä, tunnistettuja testejä omine kriteereineen.
EMA:n synteettisiä peptidejä koskeva ohje käsittelee useita tällaisia laatuparametreja lääkekehityksessä. Sitä käytetään tässä asiantuntijaviitteenä mittausten erottamiseen. Se ei tee raaka-aineesta hyväksyttyä lääkettä eikä osoita turvallisuutta ihmisillä.
Kun luet COA-todistusta, kirjaa siksi, mihin kysymykseen kukin tulos vastaa. Jos tarvittava mittaus puuttuu, se on kirjattava puuttuvaksi dokumentaatioksi sen sijaan, että aukko täytetään oletuksella toisen testin merkityksestä.
Lähteet
ArcticAmino myy tutkimusmateriaaleja. Artikkelit ovat toimittajan kirjoittamia ja kokoavat lähteitä tiedotustarkoituksessa. Ne eivät ole lääketieteellisiä neuvoja tai käyttöohjeita. Analyysitodistus ei tee tutkimusmateriaalista hyväksyttyä lääkettä.