Metodenavnet alene forteller likevel ikke hva rapporten dokumenterer. Det må være klart hvilket signal som er målt, hvilken beregning som er brukt og hvilke stoffer metoden kan skille fra hverandre.
HPLC viser separasjon under gitte forhold
HPLC står for high-performance liquid chromatography. Prøvens komponenter beveger seg gjennom en kolonne sammen med en væskestrøm. Forskjeller i samspillet med kolonnen og væsken gir ulik retensjonstid, altså tiden frem til et stoff registreres av detektoren.
Et kromatogram viser detektorens signal over tid. I peptidanalyser brukes ofte UV-deteksjon. En hovedtopp og mindre topper kan gi opplysninger om sammensetningen, men to stoffer kan også komme ut samtidig. Én topp trenger derfor ikke representere ett eneste stoff.
Retensjonstid er knyttet til analysebetingelsene. Et tidspunkt fra én metode kan ikke brukes som universell identifikasjon i en annen. Rapporten må gi nok informasjon til at laboratoriet kan forklare hva toppene og arealberegningen betyr.
LC-MS knytter masseinformasjon til toppene
Et massespektrometer registrerer ioner etter forholdet mellom masse og ladning, m/z. Peptider kan gi ioner med flere ladninger. Tolking av disse signalene kan gi en beregnet molekylmasse som sammenholdes med forventet masse.
Zeng og kolleger undersøkte LC-HRMS, væskekromatografi med høyoppløselig massespektrometri, for kvalitetskontroll av tre peptidlegemidler i 2015. Arbeidet viser hvordan masseinformasjon kan bidra til å undersøke urenheter og forskjeller mellom prøver som kromatografien alene ikke forklarer tilstrekkelig.
En masse som passer forventningen, er nyttig informasjon. Strukturer med samme masse kan likevel kreve flere undersøkelser. LC-MS/MS analyserer fragmenter av utvalgte ioner og kan gi mer informasjon om sekvensen. Hva som er bekreftet, må fremgå av selve tolkningen.
Velg målingen ut fra spørsmålet
Renhetsprofil, identitet og kvantitativt innhold krever ulike vurderinger. Ved innholdsbestemmelse trengs et definert forhold mellom mengde og målesignal. Det kan blant annet omfatte kalibrering og et egnet referansemateriale. Et areal fra en kromatografisk topp er ikke automatisk et ferdig mengdemål.
Massespektrometrisk signalstyrke påvirkes også av ionisering og instrumentforhold. To stoffer kan gi forskjellige signaler ved samme mengde. Å dele ett MS-signal på summen av alle signalene gir derfor ikke uten videre en pålitelig masseprosent.
| Spørsmål | Relevant informasjon | Begrensning |
|---|---|---|
| Hvilke komponenter skilles? | Kromatogram og metodebeskrivelse | Komponenter kan overlappe |
| Passer massen med forventningen? | Tolket LC-MS eller LC-HRMS | Samme masse kan ha flere strukturelle forklaringer |
| Er sekvensen undersøkt? | Fragmentdata fra LC-MS/MS og eventuell tilleggsanalyse | Dekning og tolkningsgrunnlag må vurderes |
| Hvor mye peptid er det? | Kvantitativ metode med definert beregningsgrunnlag | Arealrenhet alene gir ikke dette svaret |
En metode må passe til den aktuelle prøven
Selektivitet beskriver hvor godt metoden skiller analytten fra andre komponenter. Presisjon gjelder variasjonen mellom målinger; nøyaktighet gjelder hvor godt resultatene samsvarer med en akseptert referanse. Disse egenskapene vurderes for den aktuelle analyseoppgaven, ikke bare for instrumenttypen.
Studier av LC-MS/MS-systemer bruker også mål for blant annet kromatografisk ytelse, massenøyaktighet og signalstyrke. Slike kontroller kan avdekke at et system fungerer annerledes fra én serie til den neste. De er en grunn til å spørre om systemegnethet når rapporter sammenlignes.
En metode som fungerer godt for ett peptid, er ikke nødvendigvis like selektiv for et annet. Navn som HPLC-testet eller MS-bekreftet bør derfor følges av en konkret forklaring på hva testen omfatter.
Andre egenskaper krever egne undersøkelser
Sterilitet, endotoksiner og restløsemidler er egne analyseområder. Et standard kromatogram eller massespektrum gir ikke en samlet konklusjon om dem. Eventuelle resultater må finnes som separate, identifiserte tester med egne kriterier.
EMAs retningslinje for syntetiske peptider omtaler flere slike kvalitetsparametere i legemiddelutvikling. Den brukes her som faglig referanse for skillet mellom målingene. Den gjør ikke en råvare til et godkjent legemiddel og dokumenterer ikke sikkerhet hos mennesker.
Når du leser et COA, skriv derfor ned hvilket spørsmål hvert resultat besvarer. Mangler en nødvendig måling, bør den føres som manglende dokumentasjon fremfor å fylles inn med en antakelse om hva en annen test betyr.
Kilder
ArcticAmino selger forskningsmaterialer. Artiklene er skrevet av leverandøren og oppsummerer kilder til opplysningsformål. De er ikke medisinske råd eller bruksanvisninger. Et analysesertifikat gjør ikke et forskningsmateriale til et godkjent legemiddel.