Metodenavnet alene fortæller alligevel ikke hvad rapporten dokumenterer. Det skal være klart hvilket signal som er målt, hvilken beregning som er brugt og hvilke stoffer metoden kan skelne fra hinanden.
HPLC viser separation under givne forhold
HPLC står for high-performance liquid chromatography. Prøvens komponenter bevæger sig gennem en kolonne sammen med en væskestrøm. Forskelle i samspillet med kolonnen og væsken giver forskellig retentionstid, altså tiden frem til et stof registreres af detektoren.
Et kromatogram viser detektorens signal over tid. I peptidanalyser bruges ofte UV-detektion. En hovedtop og mindre toppe kan give oplysninger om sammensætningen, men to stoffer kan også komme ud samtidig. Én top behøver derfor ikke at repræsentere ét eneste stof.
Retentionstid er knyttet til analysebetingelserne. Et tidspunkt fra én metode kan ikke bruges som universel identifikation i en anden. Rapporten skal give nok information til at laboratoriet kan forklare hvad toppene og arealberegningen betyder.
LC-MS knytter masseinformation til toppene
Et massespektrometer registrerer ioner efter forholdet mellem masse og ladning, m/z. Peptider kan give ioner med flere ladninger. Fortolkning af disse signaler kan give en beregnet molekylmasse som sammenholdes med forventet masse.
Zeng og kolleger undersøgte LC-HRMS, væskekromatografi med højopløselig massespektrometri, for kvalitetskontrol af tre peptidlægemidler i 2015. Arbejdet viser hvordan masseinformation kan bidrage til at undersøge urenheder og forskelle mellem prøver som kromatografien alene ikke forklarer tilstrækkeligt.
En masse som stemmer overens med forventningen, er nyttig information. Strukturer med samme masse kan alligevel kræve flere undersøgelser. LC-MS/MS analyserer fragmenter af udvalgte ioner og kan give mere information om sekvensen. Hvad som er bekræftet, skal fremgå af selve fortolkningen.
Vælg målingen ud fra spørgsmålet
Renhedsprofil, identitet og kvantitativt indhold kræver forskellige vurderinger. Ved indholdsbestemmelse er der brug for et defineret forhold mellem mængde og målesignal. Det kan blandt andet omfatte kalibrering og et egnet referencemateriale. Et areal fra en kromatografisk top er ikke automatisk et færdigt mængdemål.
Massespektrometrisk signalstyrke påvirkes også af ionisering og instrumentforhold. To stoffer kan give forskellige signaler ved samme mængde. At dele ét MS-signal med summen af alle signalerne giver derfor ikke uden videre en pålidelig masseprocent.
| Spørgsmål | Relevant information | Begrænsning |
|---|---|---|
| Hvilke komponenter adskilles? | Kromatogram og metodebeskrivelse | Komponenter kan overlappe |
| Passer massen med forventningen? | Fortolket LC-MS eller LC-HRMS | Samme masse kan have flere strukturelle forklaringer |
| Er sekvensen undersøgt? | Fragmentdata fra LC-MS/MS og eventuel supplerende analyse | Dækning og tolkningsgrundlag skal vurderes |
| Hvor meget peptid er der? | Kvantitativ metode med defineret beregningsgrundlag | Arealrenhed alene giver ikke dette svar |
En metode skal passe til den aktuelle prøve
Selektivitet beskriver hvor godt metoden adskiller analytten fra andre komponenter. Præcision gælder variationen mellem målinger; nøjagtighed gælder hvor godt resultaterne stemmer overens med en accepteret reference. Disse egenskaber vurderes for den aktuelle analyseopgave, ikke kun for instrumenttypen.
Studier af LC-MS/MS-systemer bruger også mål for blandt andet kromatografisk ydeevne, massenøjagtighed og signalstyrke. Sådanne kontroller kan afdække at et system fungerer anderledes fra én serie til den næste. De er en grund til at spørge om systemegnethed når rapporter sammenlignes.
En metode som fungerer godt for ét peptid, er ikke nødvendigvis lige selektiv for et andet. Betegnelser som HPLC-testet eller MS-bekræftet bør derfor følges af en konkret forklaring på hvad testen omfatter.
Andre egenskaber kræver egne undersøgelser
Sterilitet, endotoksiner og rester af opløsningsmidler er egne analyseområder. Et standardkromatogram eller massespektrum giver ikke en samlet konklusion om dem. Eventuelle resultater skal findes som separate, identificerede test med egne kriterier.
EMAs retningslinje for syntetiske peptider omtaler flere sådanne kvalitetsparametre i lægemiddeludvikling. Den bruges her som faglig reference for forskellen mellem målingerne. Den gør ikke en råvare til et godkendt lægemiddel og dokumenterer ikke sikkerhed hos mennesker.
Når du læser et COA, skriv derfor ned hvilket spørgsmål hvert resultat besvarer. Mangler en nødvendig måling, bør den føres som manglende dokumentation frem for at blive udfyldt med en antagelse om hvad en anden test betyder.
Kilder
ArcticAmino sælger forskningsmaterialer. Artiklerne er skrevet af leverandøren og opsummerer kilder til oplysningsformål. De er ikke medicinske råd eller brugsanvisninger. Et analysecertifikat gør ikke et forskningsmateriale til et godkendt lægemiddel.